mRNA Cap2'-O-Metiltransferaza

mRNA Cap 2´ -O-metiltransferaza vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase üçün geni daşıyan rekombinant E. coli ştamından əldə edilmişdir.Bu ferment RNT-nin 5 ucunda qapaq strukturuna bitişik birinci nukleotidin 2´-O mövqeyinə metil qrupu əlavə edir. Ferment qapaqlı RNT-ni (qapaq) metilləşdirmək üçün metil donoru kimi S-adenosilmetionindən (SAM) istifadə edir. -0) nəticədə cap- 1 strukturu yaranır.

Cap1 strukturu transfeksiya və mikroinyeksiya təcrübələrində mRNT-nin ifadəsini təkmilləşdirərək tərcümə səmərəliliyini artıra bilər. Bu ferment substrat kimi m7GpppN qapağı olan RNT tələb edir.5´ ucunda pN, ppN, pppN və ya GpppN ilə RNT-dən istifadə edə bilməz.Qapaqlı RNT qapağın analoqundan istifadə edərək in vitro transkripsiyası və ya Vaccinia Qapaq Enzimindən istifadə edərək fermentativ qapaq vasitəsilə hazırlana bilər.

Komponentlər

mRNA Qapağı 2´-O-Metiltransferaza (50U/μL)

10 × Qapaq Reaksiya Buferi

Saxlama

Saxlama üçün -25 ～- 15 ℃ （ Təkrar dondurma-ərimə dövrlərindən çəkinin）

Saxlama buferi

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X- 100， 50% qliserin.

Vahid tərifi

Bir vahid 37°C-də 1 saat ərzində 80 nt qapaqlı RNT transkriptinin 10 pmolunu metilləşdirmək üçün tələb olunan fermentin miqdarı kimi müəyyən edilir.

Keyfiyyətə nəzarət analizləri

Exonuclease:50U mRNA Cap 2´ -O-Metiltransferaza ilə 1μg λ-Hind III həzm DNT-si 37 ℃ temperaturda 16 saat ərzində agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

Endonukleaz: 50 U mRNA Qapağı 2´ -O-Metiltransferaza ilə 1 μg λDNT ilə 37°C temperaturda 16 saat ərzində agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

Nikase: 50U mRNA Cap 2´ -O-Metiltransferaza ilə 1μg pBR322 ilə 37 ℃ temperaturda 16 saat ərzində agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

RNaz: 50U mRNA Cap 2´ -O-Metiltransferaza ilə 1.6μg MS2 RNT ilə 37°C temperaturda 4 saat ərzində agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

E. coli DNT: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase varlığı üçün yoxlanılır.E. coli üçün xüsusi primerlərlə TaqMan qPCR istifadə edərək genomik DNTE. coli 16S rRNA yeri.TheE. coli genomik DNT çirklənməsi =1-dirE. coli genom.

Bakterial Endotoksin: LAL-test, Çin Farmakopeyası IV 2020 nəşrinə uyğun olaraq, gel limit test üsulu, ümumi qayda (1143).Bakterial endotoksin tərkibi =10 AB/mq olmalıdır.

Reaksiya sistemi və şərtləri

1. Qapaqlı RNT və RNazsız H2O-nun müvafiq miqdarını 1,5 ml mikrofuge borusunda 16,0 µL yekun həcmə birləşdirin.

2. 65 ℃ temperaturda 5 dəqiqə qızdırın, ardınca 5 dəqiqə buz vannası edin.

3. Aşağıdakı komponentləri müəyyən edilmiş ardıcıllıqla əlavə edin (qapaqlı RNT-nin metilasiyası üçün

10-dan az

*10× Qapaq Reaksiya Buferi: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 37 ℃ temperaturda 1 saat inkubasiya edin (200 nt-dən az hədəf fraqment üçün 2 saat inkubasiya tövsiyə olunur).

Tətbiqlər

Mikroinyeksiya və transfeksiya təcrübələri zamanı mRNT ifadəsini yaxşılaşdırmaq.

İstifadəyə dair qeydlər

1. Reaksiyadan əvvəl RNT təmizlənməlidir və nukleazsız suda həll edilməlidir, bütün məhlullarda EDTA və ionlar olmamalıdır.

2. Transkriptin 5´ ucundakı ikincil strukturu çıxarmaq üçün reaksiyadan əvvəl nümunə RNT-ni 65 ℃ temperaturda 5 dəqiqə qızdırmaq tövsiyə olunur.Mürəkkəb 5 ´-terminal quruluşu üçün 10 dəqiqəyə qədər uzadıla bilər.