PNGase F
Peptid-N-Qlikozidaza F(PNGase F) qlikoproteinlərdən demək olar ki, bütün N ilə əlaqəli oliqosakkaridləri çıxarmaq üçün ən təsirli enzimatik üsuldur.PNGase F, N-əlaqəli qlikoproteinlərdən yüksək mannoz, hibrid və mürəkkəb oliqosakkaridlərin ən daxili GlcNAc və asparagin qalıqları arasında parçalanan amidazadır.
Ərizə
Bu ferment zülallardan karbohidrat qalıqlarının çıxarılması üçün faydalıdır.
Hazırlıq və spesifikasiya
| Görünüş | Rəngsiz maye |
| Protein təmizliyi | ≥95% (SDS-PAGE-dən) |
| Fəaliyyət | ≥500,000 U/mL |
| Ekzoqlikozidaza | Heç bir fəaliyyət aşkarlanmadı (ND) |
| Endoqlikozidaza F1 | ND |
| Endoqlikozidaza F2 | ND |
| Endoqlikozidaza F3 | ND |
| Endoqlikozidaza H | ND |
| Proteaz | ND |
Xüsusiyyətlər
| EC nömrəsi | 3.5.1.52(Mikroorqanizmdən rekombinant) |
| Molekulyar çəki | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| İzoelektrik nöqtə | 8. 14 |
| Optimal pH | 7,0-8,0 |
| Optimal temperatur | 65 °C |
| Substratın spesifikliyi | GlcNAc və asparagin qalıqları arasında qlikozid bağlarının parçalanması Şəkil 1 |
| Tanınma saytları | Tərkibində α1-3 fukoza olmadığı halda N-əlaqəli qlikanlar Şəkil 2 |
| Aktivləşdiricilər | DTT |
| İnhibitor | SDS |
| Saxlama temperaturu | -25 ~-15 ℃ |
| İstilik inaktivasiyası | 1µL PNGase F ehtiva edən 20µL reaksiya qarışığı 75 °C-də 10 dəqiqə inkubasiya yolu ilə təsirsiz hala gətirilir. |
Şəkil 1 PNGase F-nin substrat spesifikliyi
Şəkil 2 PNGase F-nin tanınması.
Daxili GlcNAc qalıqları α1-3 fukoza ilə əlaqəli olduqda, PNGase F qlikoproteinlərdən N ilə əlaqəli oliqosakkaridləri ayıra bilməz.Bu modifikasiya bitkilərdə və bəzi həşərat qlikoproteinlərində geniş yayılmışdır.
Copponentlər
|
| Komponentlər | Konsentrasiya |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Qlikoprotein Denaturasiya Buferi | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Vahid tərifi
Bir vahid(U) 10 µL ümumi reaksiya həcmində 37°C-də 1 saat ərzində 10 µg denatürasiya olunmuş RNase B-dən >95% karbohidrat çıxarmaq üçün tələb olunan fermentin miqdarı kimi müəyyən edilir.
Reaksiya şərtləri
1. 1-20 µg qlikoproteini deionlaşdırılmış su ilə həll edin, 10 µl ümumi reaksiya həcmi yaratmaq üçün 1 µl 10 × Qlikoprotein Denaturasiya Buferi və H2O (lazım olduqda) əlavə edin.
2.100°C-də 10 dəqiqə inkubasiya edin, buz üzərində soyudun.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 əlavə edin və qarışdırın.
4.1-2 µl PNGase F və H əlavə edin2O (lazım olduqda) 20 µl ümumi reaksiya həcmini hazırlayın və qarışdırın.
5.Reaksiyanı 37°C-də 60 dəqiqə inkubasiya edin.
6.SDS-PAGE analizi və ya HPLC analizi üçün.
