Vaccinia Virus Qapaq Enzimi

Vaccinia virusunu bağlayan ferment Vaccinia qapaq fermenti üçün genləri daşıyan rekombinant E. coli ştamından əldə edilmişdir.Bu tək ferment iki alt bölmədən (D1 və D12) ibarətdir və üç enzimatik fəaliyyətə malikdir (D1 alt bölməsi tərəfindən RNT trifosfataz və quaniltransferaza və D12 alt bölməsi tərəfindən quanin metiltransferaza).Vaccinia virusunun qapaqlanması fermenti xüsusi olaraq 7-metilquanilat qapaq strukturunu (m7Gppp, Cap 0) RNT-nin 5′ ucuna bağlaya bilən qapaq strukturunun formalaşmasını kataliz etmək üçün effektivdir.Qapaq quruluşu (Qapaq 0) eukariotlarda mRNT-nin sabitləşməsi, daşınması və tərcüməsində mühüm rol oynayır.Enzimatik reaksiya ilə RNT-nin qapaqlanması in vitro transkripsiya, transfeksiya və mikroinyeksiya üçün RNT-nin sabitliyini və tərcüməsini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdıra bilən effektiv və sadə üsuldur.

Komponentlər

Vaccinia Virus Qapaq Enzimi (10 U/μL)

10 × Qapaq Buferi

Saxlama şəraiti

Saxlama üçün -25～- 15℃ （ Təkrar dondurma-ərimə dövrlərindən çəkinin）

Saxlama buferi

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X- 100, 50% qliserin.

Vahid Tərifi

Vaccinia virusunun qapaqlanması fermentinin bir vahidi 37°C-də 1 saat ərzində 10pmol GTP-nin 80nt transkriptinə daxil edilməsi üçün tələb olunan fermentin miqdarı kimi müəyyən edilir.

Keyfiyyətə nəzarət

Exonuclease:37 ℃ temperaturda 16 saat ərzində 1μg λ-Hind III həzm DNT ilə 10U Vaccinia virusunun qapaqlanması fermenti agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

Endonukleaz:16 saat ərzində 37 ℃ temperaturda 1μg λDNT ilə 10U Vaccinia virusunun qapaqlanması fermenti agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

Nickase:16 saat ərzində 37 ℃ temperaturda 1 μg pBR322 ilə 10U Vaccinia virusunun qapaqlanması fermenti agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

RNaz:1,6 μg MS2 RNT ilə 10U Vaccinia virusu qapaq fermenti 37 ℃ temperaturda 4 saat ərzində agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.

1.coli DNT:10U Vaccinia virusunun qapaqlanması fermenti, E. coli 16S rRNA lokusu üçün spesifik primerlərlə TaqMan qPCR istifadə edərək E. coli genomik DNT-nin varlığı üçün yoxlanılır.E. coli genomik DNT çirklənməsi ≤1 E. coli genomudur.

2.Bakterial Endotoksin: LAL-test, Çin Farmakopeyası IV 2020 nəşrinə görə, gel limiti test üsulu, ümumi qayda (1143).Bakterial endotoksin miqdarı ≤10 AB/mq olmalıdır.

Reaksiya sistemi və şərtləri

1. Qapaq Protokolu (reaksiya həcmi: 20 μL)

Bu prosedur 10μg RNT-nin (≥100 nt) tıxanma reaksiyasına şamil edilir və eksperimental tələblərə uyğun olaraq genişləndirilə bilər.

I) 10μg RNT və Nukleazsız H2O-nu 1.5 ml mikrofuge borusunda 15.0 µL yekun həcmə birləşdirin.*10×Qapaq Buferi: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8,0)

2) 5 dəqiqə 65 ° C-də qızdırın, sonra 5 dəqiqə buz vannası edin.

3) Göstərilən ardıcıllıqla aşağıdakı komponentləri əlavə edin

*10 × Qapaq Buferi: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)

4) 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin, RNT indi qapalıdır və aşağı axın tətbiqləri üçün hazırdır.

2. 5′ terminal etiketləmə reaksiyası (reaksiya həcmi: 20 μL)

Bu protokol 5´ trifosfat ehtiva edən RNT-ni etiketləmək üçün nəzərdə tutulmuşdur və tələblərə uyğun olaraq genişləndirilə bilər.Etiketin birləşdirilməsinin səmərəliliyinə RNT-nin molar nisbəti: GTP, həmçinin RNT nümunələrindəki GTP məzmunu təsir edəcəkdir.

1) Müvafiq miqdarda RNT və Nukleazsız H2O-nu 1,5 ml mikrofuge borusunda 14,0 µL yekun həcmə birləşdirin.

2) 5 dəqiqə 65 ° C-də qızdırın, sonra 5 dəqiqə buz vannası edin.

3) Göstərilən ardıcıllıqla aşağıdakı komponentləri əlavə edin.

** GTP MIX GTP və az sayda markerə aiddir.GTP konsentrasiyası üçün baxınQeyd 3 üçün.

4) 37°C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin, RNT 5′ ucu indi etiketlənib və aşağı axın üçün hazırdır

Tətbiqlər

1. Tərcümə analizlərindən/in vitro tərcüməsindən əvvəl mRNA-nın qapaqlanması

2. mRNT-nin 5´ ucunun etiketlənməsi

İstifadəyə dair qeydlər

1.Vaccinia Capping Enzyme ilə inkubasiyadan əvvəl RNT məhlulunun qızdırılması transkriptin 5-ci ucundakı ikincil quruluşu aradan qaldırır.Məlum yüksək strukturlaşdırılmış 5 ucları olan transkriptlər üçün vaxtı 60 dəqiqəyə qədər artırın.

2. Reaksiyaların bağlanması üçün istifadə edilən RNT istifadə edilməzdən əvvəl təmizlənməlidir və nukleazsız suda dayandırılmalıdır.EDTA olmamalı və məhlulda duzlar olmamalıdır.

3. 5´ ucunu etiketləmək üçün ümumi GTP konsentrasiyası reaksiyadakı mRNT-nin molar konsentrasiyasından təxminən 1-3 dəfə çox olmalıdır.

4. Reaksiya sisteminin həcmi faktiki olaraq böyüdülə və ya azaldıla bilər.