5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Pişik nömrəsi: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) bir addımlı əks transkripsiya və kəmiyyət PCR (qRT-PCR) üçün uyğun olan yüksək stabil bir borulu zond əsaslı qarışıqdır.Astarların və zondların əvvəlcədən qarışdırılmasını dəstəkləyir və aşağı temperaturda uzun müddət saxlandıqdan sonra sabit qalır.Sınaq ediləcək nümunə istifadə zamanı əlavə boru açma/pipetləmə əməliyyatı olmadan birbaşa əlavə edilə bilər.Bu məhsul komponentləri təmin edir, məsələn, isti başlanğıc DNT polimeraza, M-MLV, istiliyə davamlı urasil DNT qlikosilaz (TS-UNG), RNase inhibitoru, MgCl2, dNTP-lər (dTTP əvəzinə dUTP ilə) və stabilizatorlar.Genetik cəhətdən dəyişdirilmiş sürətli gücləndirmə əks transkriptaza və DNT polimeraza ilə PCR gücləndirilməsini 20-40 dəqiqə ərzində başa çatdırmaq mümkündür.Bu reagent antiinhibitor gücləndirici fermentin və UNG fermentinin qarışıq fermentləri ilə qPCR üçün xüsusi buferdən istifadə edir.Buna görə də, o, hədəf genlərin yaxşı gücləndirilməsini əldə edə və PCR qalıqları və aerozol çirklənməsinin səbəb olduğu yalançı gücləndirmənin qarşısını ala bilər.Bu reagent Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad və Roche kimi istehsalçıların əksər flüoresan kəmiyyət PCR alətləri ilə uyğun gəlir.
Komponent
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Bufer (dUTP)
Saxlama şərtləri
Bütün komponentlər uzunmüddətli saxlama üçün -20 ℃ və 3 aya qədər 4 ℃ temperaturda saxlanılmalıdır.Əridikdən sonra yaxşıca qarışdırın və istifadə etməzdən əvvəl sentrifuqa edin.Tez-tez donma-ərimədən çəkinin.
qRT-PCR Reaksiya Sisteminin Hazırlanması
| Komponentlər | 25μLSistem | 50μLSistem | Son Konsentrasiya |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Bufer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Prob Qarışığıa | 1μL | 2μL | 1× |
| Şablon RNTb | – | – | – |
| gg2O | 25μL-ə qədər | 50μL-ə qədər | – |
1) a. Astarın son konsentrasiyası adətən 0,2μM-dir.Daha yaxşı nəticələr üçün primer konsentrasiyası 0,2-1μM aralığında optimallaşdırıla bilər.Ümumiyyətlə, zond konsentrasiyası 0,1-0,3μM aralığında optimallaşdırıla bilər.
2) b. Sürətli PCR Prosedurundan istifadə edərkən primerlərin və zondların konsentrasiyasının artırılması daha yaxşı gücləndirmə nəticələri ilə nəticələnə bilər və onların nisbəti müvafiq olaraq optimallaşdırılmalıdır.
3) Nümunələrin müxtəlif növləri müxtəlif növ və məzmunlu inhibitor və hədəf genin surət sayını ehtiva edir.Nümunə həcmi faktiki vəziyyətlə nəzərə alınmalıdır.Lazım gələrsə, nukleazsız su və ya TE Buferi ilə nümunəni seyreltin.
Reaksiya Cşərtlər
| Daimi PCR Proseduru | Sürətli PCR Proseduru | ||||||
| Prosedur | Temp. | Vaxt | Velosiped | Prosedur | Temp. | Vaxt | Velosiped |
| Əks Transkripsiya | 50℃ | 10-20 dəq | 1 | Əks Transkripsiya | 50℃ | 5 dəq | 1 |
| Polimeraza Aktivləşdirmə | 95℃ | 1-5 dəq | 1 | Polimeraza Aktivləşdirmə | 95℃ | 30s | 1 |
| Denatürasiya | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denatürasiya | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Qızartma və Uzatma | 56-64℃ | 20-60-lar | Qızartma və Uzatma | 56-64℃ | 3-20s | ||
Keyfiyyətə nəzarət
1.Funksiya aşkarlanması: qPCR-nin həssaslığı, spesifikliyi və təkrarlanması.
2.Ekzogen nukleaz aktivliyi yoxdur: ekzogen endonükleaz və ekzonükleaz çirklənməsi yoxdur.
Qeydlər
1.Sürətli DNT polimerazanın gücləndirmə sürəti 1kb/10s-dən az deyil.Fərqli PCR alətləri müxtəlif istilik və soyutma sürətlərinə, temperatur nəzarət rejimlərinə və istilik keçiriciliyinə malikdir və beləliklə, spesifik sürətli PCR alətinizlə birlikdə primer/zond konsentrasiyasının və işləmə metodunuzun optimallaşdırılması vacibdir.
2.Bu məhsul geniş tətbiq qabiliyyətinə malikdir və yüksək həssas molekulyar diaqnostika üçün uyğundur.Üç addımlı PCR metodu aşağı tavlama temperaturu olan primerlər və ya 200 bp-dən çox uzun fraqmentlərin gücləndirilməsi üçün tövsiyə olunur.
3.Müxtəlif amplikonların dUTP-dən fərqli istifadə səmərəliliyi və UNG-yə fərqli həssaslıq olduğundan, UNG sistemindən istifadə edərkən aşkarlama həssaslığı azalarsa, reagentlər optimallaşdırılmalıdır.Zəhmət olmasa, texniki dəstək üçün bizimlə əlaqə saxlayın.
4.Daşınan PCR məhsullarının gücləndirilməsinin qarşısını almaq üçün gücləndirmə üçün xüsusi eksperimental sahə və pipet tələb olunur.Əlcəklərlə işləyin və tez-tez dəyişdirin və gücləndirildikdən sonra PCR borusunu açmayın.
