EndoFree Plasmid Maxi Kit

Saxlama şəraiti

RNaseA -30 ~ -15 ℃ temperaturda saxlanmalı və ≤ 0 ℃ temperaturda daşınmalıdır.

Endotoksin Təmizləyicisi bir ay ərzində 2 ~ 8 ℃ temperaturda, uzunmüddətli saxlama üçün -30 ~ -15 ℃ temperaturda saxlanıla bilər.və ≤0℃ temperaturda daşınır.

Digər komponentlər otaq temperaturunda (15 ~ 25 ℃) saxlanmalı və otaq temperaturunda daşınmalıdır.

Komponentlər

RNaseA:10 mq/ml, RNT-ni çıxarmaq üçün istifadə olunur.

Bufer P1:bakterial suspenziya tamponu, ilk istifadədən əvvəl P1 Buferinə RNaseA əlavə edin.

Bufer P2:bakterial liziz tamponu (tərkibində SDS/NaOH).

Bufer P4:neytrallaşdırıcı tampon.

Endotoksin Təmizləyicisi:xam plazmid ekstraktından endotoksini effektiv şəkildə çıxarın.

Bufer PW:buferi yuyun, ilk istifadədən əvvəl nəzərdə tutulmuş həcmdə etanol əlavə edin.

Bufer TB:elüsyon tamponu.

FastPure DNT Maxi Sütunları:plazmid DNT adsorbsiya sütunları.

Kolleksiya boruları 50 ml:filtrat toplama boruları.

Endotoksinsiz Toplama Borusu:plazmid DNT toplama boruları.

Hazırlanmış Materiallar

Mütləq etanol, izopropanol, 50 ml dairəvi dibli sentrifuqa boruları və 50 ml endotoksinsizsentrifuqa boruları.

Tətbiqlər

Bu məhsul 150 - 300 ml bakterial məhluldan plazmidlərin geniş miqyaslı çıxarılması üçün uyğundur.bir gecədə yetişdirilir.

Təcrübə Prosesi

1. Gecədə becərilmiş 150 – 200 ml (300 ml-dən çox olmayan) bakterial məhlul götürün və saatda sentrifuqa edin.təxminən 11,000 rpm (12,000 × g) 1 – 2 dəqiqə.Supernatantı atın və bakteriyaları toplayın.

Δ 50 ml-dən çox bakterial məhlul toplanarkən, bakteriya məhlulunun əlavə edilməsi, sentrifuqalama, supernatantın atılması və digər addımlar üçün eyni 50 ml boruda toplana bilər.

dəfələrlə.

2. Sentrifuqaya 7,5 ml Bufer P1 əlavə edin (zəhmət olmasa, P1 Buferinə RNaseA əlavə edilib-edilmədiyini yoxlayın)tərkibində bakteriya olan boruya qoyun və burulğan və ya pipetləmə ilə hərtərəfli qarışdırın.

Δ Bu mərhələdə bakteriyaların tam resuspenziyası məhsul əldə etmək üçün çox vacibdir və yenidən suspenziyadan sonra heç bir bakteriya toplanması olmamalıdır.Əgər hərtərəfli qarışdırılmamış bakteriya yığınları varsa, bu, lizisə təsir edəcək, nəticədə aşağı məhsuldarlıq və təmizlik olacaq.Əgər bakterial məhlulun OD600-i 0,65 olarsa, 150 ml bakterial məhluldan ekstraksiya zamanı 7,5 ml P1 Buferindən istifadə etmək tövsiyə olunur;OD600 0,75 olduqda, 8 ml Bufer P1 istifadə edilməli və P2 və P4 Buferlərinin həcmləri müvafiq olaraq dəyişdirilməlidir.Bakterial məhlulun həcmi 200 ml-ə qədər artırıldıqda, tövsiyə olunurP1, P2 və P4 tamponlarının həcmi mütənasib olaraq artırılmalıdır.

3. 2-ci addımdan bakterial suspenziyaya 7,5 ml Bufer P2 əlavə edin və 6-8 müddətində yumşaq bir şəkildə yuxarı və aşağı qarışdırın.dəfə və otaq temperaturunda 4-5 dəqiqə inkubasiya edin.

Δ Hərtərəfli qarışdırmaq üçün yavaş-yavaş çevirin.Vorteksləmə genomik DNT parçalanmasına səbəb olacaq, nəticədə ekstraksiya edilmiş plazmiddə genomik DNT fraqmentləri yaranacaq.Bu zaman məhlul özlü və şəffaf olur ki, bu da bakteriyaların tam parçalandığını göstərir.Plazmidlərin məhv edilməməsi üçün müddət 5 dəqiqədən çox olmamalıdır.Həll aydın deyilsə, nəticədə çoxlu bakteriya ola bilərnatamam lizis, buna görə də bakteriyaların miqdarı müvafiq olaraq azaldılmalıdır.

4. 3-cü addımdan bakterial suspenziyaya 7,5 ml P4 Buferi əlavə edin və məhlulun P2 Buferini tamamilə neytrallaşdırmaq üçün dərhal yavaş-yavaş 6-8 dəfə çevirin.Bu zaman ağ flokulyant çöküntü görünməlidir.Təxminən 11.000 rpm-dən (12.000 × g) 10-15 dəqiqə ərzində santrifüj edin, supernatantı diqqətlə yeni 50 ml yuvarlaq dibli sentrifuqa borusuna (öz-özünə hazırlanmış) pipetlə vurun vəüzən ağ çöküntünü aspire edin.

Δ Bufer P4 əlavə edin və yaxşı qarışdırmaq üçün dərhal çevirin.Neytralizasiyaya təsir edə biləcək yerli çöküntülərin əmələ gəlməsinin qarşısını almaq üçün ağ çöküntü məhlul boyunca bərabər paylanana qədər borunu dayanması üçün buraxın.Əgər sentrifuqadan əvvəl vahid ağ flokulyant çöküntü yoxdursa və sentrifuqadan sonra supernatant aydın deyilsə, borubaşqa 5 dəqiqə sentrifuqa edilir.

5. 4-cü addımdan yuxarıya 0.1 dəfə həcmdə (supernatantın həcminin 10%-i, təxminən 2.2 ml) Endotoksin Təmizləyicisini əlavə edin və qarışdırmaq üçün çevirin.Məhlulu buz banyosuna qoyun və ya məhlul bulanıqdan şəffaf və şəffaflaşana qədər 5 dəqiqə ərzində əzilmiş buza (və ya soyuducu dondurucuya) daxil edin (və ya hələ dəaz bulanıq) və bəzən bir neçə dəfə qarışdırın.

Δ Endotoksin Təmizləyicisi supernatana əlavə edildikdən sonra supernatant bulanıqlaşacaq, lakinsupernatant buz banyosunda soyuduqdan sonra şəffaflaşmalıdır (və ya bir qədər bulanıq).

6. Supernatant otaq temperaturunda (>25℃) 10-15 dəqiqə yerləşdirildikdən sonra o, bulanıqlaşacaq.onun temperaturu otaq istiliyinə qədər yüksəlir.Sonra supernatant qarışdırmaq üçün ters çevrilməlidir.

Δ Otaq temperaturu aşağı olarsa və ya ekstraksiya müddətini azaltmaq istəyirsinizsə, supernatant 37 ~ 42 ℃ su banyosunda 5 – 10 dəqiqə ərzində inkubasiya edilə bilər və növbəti addım supernatantdan sonra həyata keçirilə bilər.bulanıq olur.

7. Fazanı ayırmaq üçün otaq temperaturunda (temperatur >25 ℃ olmalıdır) 10 dəqiqə ərzində təqribən 11,000 rpm (12,000 × g) sürətlə sentrifuqa edin.Üst sulu fazada DNT, aşağı mavi yağlı fazada isə endotoksin və digər çirklər var.köçürünYeni bir boruya DNT tərkibli sulu faza vəyağlı təbəqəni atın.

Δ Mərkəzdənqaçma zamanı temperatur 25℃-dən yuxarı olmalıdır, çünki effektiv faza ayrılması yoxdurtemperatur çox aşağı olduqda baş verir.

Δ Fazaların ayrılması effektiv deyilsə, sentrifuqalama temperaturu 30℃-ə qədər tənzimlənə bilər vəsentrifuqalama müddəti 15 dəqiqəyə qədər artırıla bilər.

Δ Mavi yağlı təbəqəni sormayın, çünki onun tərkibində endotoksin və digər çirklər var.

Mexanizm

Resuspension Lizisin neytrallaşdırılması

◇ 7,5 ml Bufer P1 əlavə edin

◇ 7,5 ml Bufer P2 əlavə edin

◇ 7,5 ml Bufer P4 əlavə edin

Endotoksinlərin çıxarılması

◇Endotoxin Scavenger-in supernatant həcminin 0. 1 qatını əlavə edin

Bağlama və yuyulma

◇ İzopropanolun həcmindən 0,5 dəfə əlavə edin

◇ 10 ml Bufer PW əlavə edin