M-MLV tərs transkriptaza
RevScript Reverse transkriptaza gen mühəndisliyi texnologiyası ilə əldə edilir.Daha yüksək cDNA sintez qabiliyyətinə, istilik sabitliyinə və reaksiya temperaturu həddinə (60°C-ə qədər) malikdir.Sintez edilmiş cDNT məhsulu 10 kb-a qədərdir.Şablonların yaxınlığını artırır və mürəkkəb ikincil quruluşa və ya aşağı surətli genlərə malik RNT şablonlarının tərs transkripsiyası üçün uyğundur.
Komponentlər
| Komponent | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Əks Transkriptaza (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript Bufer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Saxlama Vəziyyəti
Bu məhsul 2 il ərzində -25°C~-15°C temperaturda saxlanmalıdır.
Vahid Tərifi
Bir vahid primer kimi Oligo(dT) istifadə edərək 37°C-də 10 dəqiqə ərzində 1 nmol dTTP-ni turşuda həll olunmayan materiala daxil edir.
Reaksiya Quraşdırma
1.RNT şablonunun denatürasiyası (Bu addım isteğe bağlıdır, RNT şablonunun denaturasiyası ikincil strukturların açılmasına kömək edir ki, bu da birinci zəncir cDNT-nin məhsuldarlığını yaxşılaşdıracaq.)
| Komponentlər | Həcmi (μL) |
| RNase pulsuz ddH2O | 13-ə |
| Oliqo(dT)18 (50 μmol/L) və ya Random Primer (50 μmol/L) Və ya Gen Xüsusi Astarlar (2 μmol/L) | 1 |
| və ya 1 | |
| və ya 1 | |
| RNT şablonu | X a |
Qeydlər:
1) a: Ümumi RNT: 1-5 ug və ya mRNT: 1-500 ng
2) 65°C-də 5 dəqiqə inkubasiya edin, sonra 2 dəqiqə soyumaq üçün dərhal buz üzərinə köçürün.Reaksiya mayesini toplamaq üçün qısa sentrifuqalama, aşağıdakı cədvəldə göstərildiyi kimi əks transkripsiya reaksiyası məhlulunu əlavə edin.Qarışdırmaq üçün yumşaq bir şəkildə pipetka ilə çəkin.
1.Reaksiya qarışığının hazırlanması (20 μL həcm)
| Komponentlər | Həcmi (μL) |
| Əvvəlki addımın qarışığı | 13 |
| 5 × Bufer | 4 |
| dNTP Qarışığı (10nmol/L) | 1 |
| Əks Transkriptaza (200 U/μL) | 1 |
| RNaz inhibitoru (40 U/μL) | 1 |
1.Reaksiyanı aşağıdakı şərtlərdə həyata keçirin:
| Temperatur (°C) | Vaxt |
| 25 °Ca | 5 dəq |
| 42 °Cb | 15-30 dəq |
| 85 °Cc | 5 dəq |
Qeydlər:
1) a.25°C-də 5 dəqiqə inkubasiya yalnız təsadüfi heksamerlərdən istifadə etmək üçün tələb olunur.Oligo (dT) istifadə edərkən bu addımı atlayın18və ya Gen Xüsusi Primer.
2) b.Tövsiyə olunan tərs transkripsiya temperaturu 42°C-dir. Mürəkkəb ikinci dərəcəli strukturlara və ya yüksək GC tərkibinə malik şablonlar üçün reaksiya temperaturunu 50-55°C-ə qaldırmaq tövsiyə olunur.
3) c.Əks transkriptazı inaktiv etmək üçün 5 dəqiqə 85°C-də qızdırılır.
4) Məhsul birbaşa PCR və ya qPCR reaksiyalarında istifadə edilə bilər və ya qısamüddətli saxlama üçün -20°C-də saxlanıla bilər.Uzun müddətli saxlama üçün məhsulları bir-birinə qatmaq və -80°C temperaturda saxlamaq tövsiyə olunur.Tez-tez donma-ərimədən çəkinin.
5) Məhsul bir addımlı RT-qPCR üçün uyğundur, hər 25μL reaksiya sistemi üçün 10-20 U əks transkriptaza əlavə etmək və ya faktiki vəziyyətə uyğun olaraq əks transkriptazın miqdarını tədricən artırmaq tövsiyə olunur.
Qeydlər
1.Təcrübə sahəsini təmiz saxlayın;Əməliyyat zamanı təmiz əlcəklər və maskalar taxılmalıdır.Təcrübədə istifadə olunan bütün istehlak materialları RNase çirklənməsinin qarşısını almaq üçün RNazsız olmalıdır.
2.RNT deqradasiyasının qarşısını almaq üçün bütün prosedurlar buz üzərində aparılmalıdır.
3.Əks transkripsiyanın yüksək effektivliyini təmin etmək üçün yüksək keyfiyyətli RNT nümunələri tövsiyə olunur.
4.Bu məhsul yalnız tədqiqat istifadəsi üçündür.
5.Təhlükəsizliyiniz üçün laboratoriya paltarları və birdəfəlik əlcəklərlə işləyin.
