Siçan genotipləmə dəsti
Pişik nömrəsi: HCR2021A
Bu məhsul siçan genotiplərinin, o cümlədən DNT-nin xam ekstraksiyası və PCR gücləndirmə sisteminin sürətli identifikasiyası üçün nəzərdə tutulmuş dəstdir.Məhsul Lizis Bufer və Proteinaz k tərəfindən sadə parçalanmadan sonra birbaşa siçan quyruğu, qulaq, ayaq barmağı və digər toxumalardan PCR gücləndirilməsi üçün istifadə edilə bilər.Gecədə həzm olunmur, fenol-xloroformun çıxarılması və ya sütunun təmizlənməsi sadədir və təcrübələrin vaxtını qısaldır.Məhsul 2kb-a qədər hədəf fraqmentlərin gücləndirilməsi və 3 cütə qədər primerlə multipleks PCR reaksiyaları üçün uyğundur.2×Mouse Tissue Direct PCR Mix tərkibində genetik olaraq hazırlanmış DNT polimeraza, Mg var.2+, dNTP-lər və yüksək gücləndirmə səmərəliliyi və inhibitorlara dözümlülük təmin etmək üçün optimallaşdırılmış bufer sistemi, beləliklə, şablon və primerlər əlavə etməklə və məhsulu 1×-ə rehidratlaşdırmaqla PCR reaksiyaları həyata keçirilə bilər.Bu məhsulla gücləndirilmiş PCR məhsulunun 3′ ucunda görkəmli “A” bazası var və təmizləndikdən sonra birbaşa TA klonlanması üçün istifadə oluna bilər.
Komponentlər
| Komponent | Ölçü |
| 2 × Siçan toxuması birbaşa PCR qarışığı | 5×1,0 ml |
| Lizis tamponu | 2×20ml |
| Proteinaz K | 800μL |
Saxlama şərtləri
Məhsullar -25~-15°C temperaturda 2 il saxlanmalıdır.Əridikdən sonra Lizis Buferi qısa müddətli çoxlu istifadə üçün 2~8℃ temperaturda saxlanıla bilər və istifadə edərkən yaxşıca qarışdırılır.
Ərizə
Bu məhsul siçan nokaut analizi, transgen aşkarlama, genotipləşdirmə və s. üçün uyğundur.
Xüsusiyyətləri
1.Sadə əməliyyat: genomik DNT çıxarmağa ehtiyac yoxdur;
2.Geniş tətbiq: müxtəlif siçan toxumalarının birbaşa gücləndirilməsi üçün uyğundur.
Təlimatlar
1.Genomik DNT-nin sərbəst buraxılması
1) Lizatın hazırlanması
Toxuma lizatı parçalanacaq siçan nümunələrinin sayına görə hazırlanır (toxuma lizatı dozaya uyğun olaraq yerində hazırlanmalı və istifadə üçün hərtərəfli qarışdırılmalıdır) və bir nümunə üçün tələb olunan reagentlərin nisbəti aşağıdakı kimidir:
| Komponentlər | Həcm (μL) |
| Proteinaz K | 4 |
| Lizis tamponu | 200 |
2) Nümunənin hazırlanması və lizis
Tövsiyə olunan Doku İstifadəsi
| növüDoku | Tövsiyə olunan həcm |
| Siçan quyruğu | 1-3 mm |
| Siçan qulağı | 2-5 mm |
| Siçan barmağı | 1-2 ədəd |
Təmiz sentrifuqa borularında müvafiq miqdarda siçan toxuması nümunələri götürün, hər bir sentrifuqa borusuna 200 μL təzə toxuma lizat əlavə edin, burulğan edin və silkələyin, sonra 30 dəqiqə ərzində 55 ℃ temperaturda inkubasiya edin və sonra 3 dəqiqə ərzində 98 ℃ temperaturda qızdırın.
3) sentrifuqasiya
Lizatı yaxşı silkələyin və 12000 rpm-də 5 dəqiqə sentrifuqa edin.Supernatant PCR gücləndirilməsi üçün şablon kimi istifadə edilə bilər.Şablon saxlama üçün lazımdırsa, supernatantı başqa steril sentrifuqa borusuna köçürün və 2 həftə ərzində -20 ℃ temperaturda saxlayın.
2.PCR gücləndirilməsi
2×Mouse Tissue Direct PCR Mix-i -20°C-dən çıxarın və buz üzərində əridin, tərs qarışdırın və aşağıdakı cədvələ uyğun olaraq PCR reaksiya sistemini hazırlayın (buz üzərində işləyin):
| Komponentlər | 25μLSistem | 50μLSistem | Son Konsentrasiya |
| 2 × Siçan toxuması birbaşa PCR qarışığı | 12.5μL | 25μL | 1× |
| Primer 1 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | 0.4μM |
| Primer 2 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | 0.4μM |
| Bölmə məhsulua | Tələb olunduğu kimi | Tələb olunduğu kimi |
|
| gg2O | 25μL-ə qədər | 50μL-ə qədər |
|
Qeyd:
a) Əlavə edilmiş miqdar sistemin 1/10-dan çox olmamalıdır və çox əlavə edilərsə, PCR gücləndirilməsi maneə törədilə bilər.
Tövsiyə olunan PCR şərtləri
| Velosiped addımı | Temp. | Vaxt | Velosipedlər |
| İlkin denatürasiya | 94℃ | 5 dəq | 1 |
| Denatürasiya | 94℃ | 30san | 35-40 |
| Qızartmaa | Tm+3~5℃ | 30san | |
| Uzatma | 72℃ | 30 san/kb | |
| Son uzadılma | 72℃ | 5 dəq | 1 |
| - | 4℃ | Tutun | - |
Qeyd:
a) Qızdırma temperaturu: Astarın Tm dəyərinə istinad edərək, yumşalma temperaturunu astarın daha kiçik Tm dəyərinə +3~5℃ təyin etmək tövsiyə olunur.
Ümumi problemlər və həll yolları
1.Məqsədli zolaqlar yoxdur
1) Həddindən artıq lizis məhsulu.Ən uyğun şablon miqdarını seçin, adətən sistemin 1/10 hissəsindən çox deyil;
2) Çox böyük nümunə ölçüsü.Lizatı 10 dəfə sulandırın və sonra gücləndirin və ya nümunə ölçüsünü azaldın və yenidən lizisi həyata keçirin;
3) Toxuma nümunələri təzə deyil.Təzə toxuma nümunələrindən istifadə etmək tövsiyə olunur;
4) Astar keyfiyyətinin aşağı olması.Primer keyfiyyətini yoxlamaq və primer dizaynını optimallaşdırmaq üçün gücləndirmə üçün genomik DNT istifadə edin.
2.Qeyri-spesifik gücləndirmə
1) Yuvlama temperaturu çox aşağıdır və dövr sayı çox yüksəkdir.Yuvlama temperaturunu artırın və dövrlərin sayını azaldın;
2) Şablon konsentrasiyası çox yüksəkdir.Şablonun miqdarını azaldın və ya gücləndirdikdən sonra şablonu 10 dəfə seyreltin;
3) Zəif primer spesifikliyi.Astar dizaynını optimallaşdırın.
Qeydlər
1.Nümunələr arasında çarpaz çirklənmənin qarşısını almaq üçün bir neçə nümunə götürmə aləti hazırlanmalı və təkrar istifadə tələb olunarsa, hər nümunədən sonra alətlərin səthi 2% natrium hipoxlorit məhlulu və ya nuklein turşusu təmizləyicisi ilə təmizlənə bilər.
2.Təzə siçan toxumalarından istifadə etmək tövsiyə olunur və gücləndirmə nəticələrinə təsir etməmək üçün nümunə götürmə həcmi çox böyük olmamalıdır.
3.Lysis Bufer tez-tez donma-ərimədən qaçmalıdır və qısamüddətli çoxlu istifadə üçün 2~8℃ temperaturda saxlanıla bilər.Aşağı temperaturda saxlanılarsa, çöküntü baş verə bilər və istifadə etməzdən əvvəl tamamilə həll edilməlidir.
4.PCR Mix tez-tez dondurulma-ərimədən qaçınmalıdır və qısamüddətli təkrar istifadə üçün 4℃ temperaturda saxlanıla bilər.
5.Bu məhsul yalnız elmi eksperimental tədqiqat üçündür və klinik diaqnoz və ya müalicədə istifadə edilməməlidir.
