Bitki birbaşa PCR dəsti
Pişik №: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit bitki yarpaqlarının, toxumlarının və s.-nin birbaşa gücləndirilməsi üçün uyğundur və tərkibində polisaxaridlər və polifenollar olmayan bitki nümunələrinin yüksək məhsuldarlıqlı skrininqi üçün istifadə edilə bilər.İstiqamətləndirilmiş təkamül əsasında birbaşa gücləndirilmiş DNT polimerazı bitkilərdə PCR inhibitorlarına qarşı üstün tolerantlığa malikdir.Eyni zamanda, 5 kb daxilində DNT fraqmentlərinin gücləndirilməsi üçün uyğun olan yüksək gücləndirmə performansını saxlayır.Dəstdəki unikal Lizis buferi A təzə və ya dondurulmuş bitki toxumalarını lizis etmək üçün istifadə edilə bilər.İstifadəsi asandır və lizat təmizlənmədən gücləndirmə üçün şablon kimi istifadə edilə bilər.Sistemdə təkrar dondurma və ərimədən sonra xam nümunələrin effektiv şəkildə gücləndirilməsinə imkan verən qoruyucu maddələr var.2 × Plant Direct Master Mix, gücləndirmə reaksiyasını yerinə yetirmək üçün yalnız primerlər və şablonlar əlavə etməlidir, beləliklə, pipetləmə əməliyyatlarını azaldır və aşkarlama qabiliyyətini və nəticələrin təkrar istehsalını yaxşılaşdırır.
Komponentlər
| Komponentlər | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Bitki Birbaşa Master Qarışığı | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Bitki birbaşa lizisi tamponu A | 5 ml | 20 ml |
| Bitki Birbaşa Lizis Buferi B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Bufer B, nümunələrin saxlanma müddətini uzatmaq üçün Bitki Birbaşa Lizis Bufer A-nı neytrallaşdırmaq üçün istifadə edilən isteğe bağlı reagentdir.Faktiki vəziyyətə uyğun olaraq istifadə edilə bilər.
Saxlama şərtləri
2 × Bitki Birbaşa Master Qarışığı, -30 ~ -15 ℃ temperaturda saxlayın və təkrar dondurulma və ərimədən qaçın;Bitki Birbaşa Lizis Buferi, -30 ~ -15 ℃ və ya 2 ~ 8 ℃ temperaturda saxlayın.
Təcrübə Prosesi
Nümunə emalı–Bitki yarpağı
Birbaşa üsul:Gənc yarpaqlardan istifadə etmək tövsiyə olunur.Kiçik və vahid nümunə əldə etmək üçün 0,5 – 3 mm sabit diametrli deşikdən istifadə edin və sonra nümunəni birbaşa PCR sisteminə əlavə edin (50 μl sistemi tövsiyə olunur).Qeyd edək ki, nümunənin boru divarına qarşı deyil, PCR məhlulunda olduğundan əmin olun.Uzun fraqmentləri və mürəkkəb nümunələri gücləndirmək üçün birbaşa PCR istifadə edilərsə, şablon kimi daha kiçik diametrli (0,5 – 1 mm) nümunədən istifadə daha yaxşı nəticələr əldə etməyə kömək edə bilər.
Taşlama lizisi üsulu:Gənc yarpaqlardan istifadə etmək tövsiyə olunur.Kiçik bir yarpaq parçası (diametri təxminən 1 – 3 mm) götürün, onu 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab-a qoyun və mümkün qədər əzin (bu addım yarpağı 100 μl pipet ucu ilə sıxmaqla həyata keçirilə bilər. nümunəni əzmək üçün).Daha böyük həcmdə yarpaq toxuması istifadə edilərsə (7 mm-dən çox olmamalıdır), seyreltmə tamponunun həcmini 50 μl-ə qədər artırın.Yarpaqlar üyüdüldükdən sonra həll yaşıl görünməlidir.Qısa sentrifuqadan sonra reaksiya şablonu kimi 1 μl supernatantı PCR sisteminə əlavə edin.
Termal liziz üsulu:Gənc yarpaqlardan istifadə etmək tövsiyə olunur.Kiçik bir yarpaq parçası (diametri təxminən 1-3 mm) götürün, onu 20 μl Bitki Birbaşa Lizis Bufer A-ya qoyun və 5-10 dəqiqə ərzində 95°C-də qızdırın.Çətin parçalanan yarpaqlar üçün lizis müddəti müvafiq olaraq uzadıla bilər (20 dəqiqədən çox deyil).Daha böyük həcmdə yarpaq toxuması istifadə edilərsə (7 mm-dən çox olmamalıdır), seyreltmə tamponunun həcmini 50 μl-ə qədər artırın.Qızdırıldıqdan sonra qısa müddətə sentrifuqa edin və reaksiya şablonu kimi PCR sisteminə 1 μl supernatant əlavə edin.
Nümunə emalı- Bitki Toxumu
Taşlama lizisi üsulu:5 mm diametrli toxumları kəsmək üçün neştərdən istifadə edin, onları 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A-ya əlavə edin və nümunəni pipet ucu və ya digər alətlərlə üyüdün.Qısaca burulğan edin və otaq temperaturunda 3-5 dəqiqə buraxın.Toxum nümunəsinin seyreltmə tamponuna batırıldığından əmin olun.Qısa sentrifuqadan sonra reaksiya şablonu kimi 1 μl supernatantı PCR sisteminə əlavə edin.
Termal liziz üsulu:5 mm diametrli toxumları kəsmək üçün neştərdən istifadə edin, onları 100 μl Bitki Birbaşa Lizis Bufer A əlavə edin və 95°C-də 5-10 dəqiqə qızdırın.Çətin parçalanan yarpaqlar üçün lizis müddəti müvafiq olaraq uzadıla bilər (30 dəqiqədən çox deyil).Qızdırıldıqdan sonra qısa müddətə sentrifuqa edin və reaksiya şablonu kimi PCR sisteminə 1 μl supernatant əlavə edin.
a.Qayçı və ya digər alətlər də uyğun ölçülü nümunələri kəsmək üçün istifadə edilə bilər;punch və ya qayçı təkrar istifadə olunarsa, nümunələr arasında çarpaz çirklənmənin qarşısını almaq üçün hər istifadədən əvvəl 2% natrium hipoxlorit məhlulu ilə təmizlənməlidir.
b.İstifadə etməzdən əvvəl Bitki Birbaşa Lizis Buferinin tam əridiyinə əmin olun.Tampon özlüdürsə və ya çöküntülər varsa, istifadə etməzdən əvvəl onu tamamilə əritmək üçün 37 ° C-də qızdırıla bilər.
c.Reaksiya sistemindəki şablonun həcmi bitki materialının və əlavə olunan seyrelticinin həcmindəki fərqə uyğun olaraq müvafiq qaydada tənzimlənə bilər.
Bitki birbaşa lizisi tamponu
Bu məhsulun tərkibində olan Bitki Birbaşa Lizis Bufer A, əksər bitki toxumalarının genomunu sərbəst buraxmaq üçün ciddi şəkildə optimallaşdırılmışdır və xam bitkilərin 4℃ temperaturda qısamüddətli saxlanması üçün uyğundur.Nümunənin daha uzun müddət (məsələn, 1 – 2 ay) saxlanması lazımdırsa, supernatantı yeni EP borusuna köçürmək və onu -20 ℃ temperaturda saxlamaq tövsiyə olunur.Nümunələri daha stabil saxlamaq üçün köçürülmüş supernatant üzərinə bərabər həcmdə Bitki Birbaşa Lizis Bufer B əlavə edin, yaxşı qarışdırın və -20°C temperaturda saxlayın.Stabil saxlama müddəti bitki nümunələri və dövlətlərə görə dəyişir.
Reaksiya sistemi
| gg2O | 20,0 µl-ə qədər | 50,0 µl-ə qədər |
| 2 × Bitki Birbaşa Master Qarışığıa | 10,0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Bitki yarpağı/xam ekstraktı nümunəsi(Nümunələrin işlənməsinə baxın) | 0,5 – 3 mm yarpaq diski/x µl | 0,5 – 3 mm yarpaq diski/x µl |
a.Tərkibində Mg var2+2 mM son konsentrasiyada.
b.Hər bir primer üçün 0,4μM yekun konsentrasiyadan istifadə etmək tövsiyə olunur.Primerlərin həddindən artıq istifadəsi qeyri-spesifik gücləndirmənin artmasına səbəb olacaqdır.
c.İstifadə olunan nümunənin miqdarı faktiki vəziyyətə uyğun olaraq tənzimlənə bilər.Xam parçalanmış nümunənin bir reaksiyasında istifadə olunan miqdar reaksiyanın ümumi həcminin 2%-20%-i arasında tənzimlənə bilər.Həddindən artıq nümunələrdən istifadə gücləndirmə uğursuzluğuna səbəb ola bilər.
Reaksiya proqramı
| Addımlar | Temperatur | Vaxt |
| İlkin denatürasiya | 98℃ | 5 dəq |
| Denatürasiya | 95℃ | 10 san |
| Qızartma | 58 ~ 72 ℃ | 15 san |
| Uzatma | 72℃ | 30 san |
| Son Uzatma | 72℃ | 5 dəq |
a.İlkin denatürasiya (98 ℃, 5 dəq) PCR gücləndirilməsi üçün istifadə oluna bilən genomik DNT-ni buraxaraq bitki toxumasının lizisini təşviq edir.Vaxtı qısaltmayın və temperaturu azaltmayın.
b.Onu primer Tm dəyərinə bərabər və ya Tm dəyərindən 2 ~ 4℃ yüksək təyin etmək tövsiyə olunur.Bu məhsulda istifadə edilən birbaşa gücləndirici DNT polimerazı adi Taq DNT polimerazasından fərqlidir və reaksiyanın yumşalma temperaturu üçün xüsusi tələblərə malikdir; yüksək yumşalma temperaturunun istifadəsi qeyri-spesifik gücləndirməni effektiv şəkildə azalda və gücləndirmə səmərəliliyini yaxşılaşdıra bilər.Mürəkkəb şablonlar üçün yumşalma temperaturunu tənzimləmək və uzatma müddətini uzatmaqla səmərəli gücləndirmə əldə edilə bilər.
c.Gücləndirici məhsulun uzunluğu ≤1 kb olarsa, uzadılma müddəti 30 san/kb müəyyən edilir;gücləndirmə məhsulunun uzunluğu >1 kb olarsa, uzadılma müddəti 60 san/kb müəyyən edilir.
d.Kompleks nümunələr və ya aşağı gücləndirmə məhsuldarlığı olan nümunələr üçün dövrlərin sayı müvafiq olaraq 40-50 dövrə qədər artırıla bilər.
Tətbiqlər
Bitki toxumalarının birbaşa gücləndirilməsi və tərkibində polisaxaridlər və polifenollar olmayan bitki nümunələrinin yüksək məhsuldarlıqlı skrininqi üçün tətbiq edilir.
Qeydlər
Yalnız tədqiqat istifadəsi üçün.Diaqnostik prosedurlarda istifadə olunmur.
1. Xam bitki amplifikasiyası və ya birbaşa amplifikasiya üçün sistemin, primerlərin və əməliyyatların düzgün olmasını təmin etmək üçün eksperimentə başlamazdan əvvəl müsbət nəzarət kimi təmizlənmiş genomik DNT-dən istifadə etmək tövsiyə olunur.
2. Bu dəstdə istifadə olunan birbaşa gücləndirici DNT polimerazı güclü yoxlama fəaliyyətinə malikdir.Əgər TA klonlaması aparılmalıdırsa, adenini əlavə etməzdən əvvəl DNT-ni təmizləmək tövsiyə olunur.
3. Primer Dizayn Rəhbərliyi:
a.Astarın 3′ ucundakı son bazanın G və ya C olması tövsiyə olunur.
b.Astarın 3′ sonundakı son 8 əsasda ardıcıl uyğunsuzluqlardan qaçınmaq lazımdır.c.Astarın 3′ ucunda saç sancağı quruluşlarından qaçın.
d.İrəli astarın və tərs astarın Tm dəyərindəki fərqlər 1℃-dən çox olmamalıdır və Tm dəyəri 60 ~ 72℃-ə düzəldilməlidir (Tm dəyərini hesablamaq üçün Primer Premier 5 tövsiyə olunur).
e.Şablonla uyğun gəlməyən əlavə əlavə primer ardıcıllıqları primer Tm dəyərinin hesablanması zamanı daxil edilməməlidir.
f.Astarın GC tərkibinin 40% -60% olması tövsiyə olunur.
g.Astarda A, G, C və T-nin ümumi paylanması mümkün qədər bərabər olmalıdır.Yüksək GC və ya AT məzmunu olan bölgələrdən istifadə etməyin.
h.Primer daxilində və ya iki primer arasında 5 və ya daha çox əsasdan ibarət tamamlayıcı ardıcıllığın mövcudluğundan qaçın və iki primerin 3′ ucunda 3 və ya daha çox əsasdan ibarət tamamlayıcı ardıcıllığın mövcudluğundan qaçın.
i.Qeyri-spesifik gücləndirmənin qarşısını almaq üçün primerin spesifikliyini yoxlamaq üçün NCBI BLAST funksiyasından istifadə edin.
