Proteinaz K NGS (toz)
Pişik nömrəsi: HC4507A
NGS Proteaz K yüksək ferment aktivliyi və geniş substrat spesifikliyi ilə sabit serin proteazdır. Ferment hidrofobik amin turşularının, kükürd tərkibli amin turşularının və aromatik amin turşularının C-terminalına bitişik olan efir bağlarını və peptid bağlarını üstünlüklə parçalayır.Beləliklə, tez-tez zülalları qısa peptidlərə parçalamaq üçün istifadə olunur.NGS Proteaz K, Asp ilə tipik bir serin proteazdır39-Onun69-Ser224Serin proteazlara xas olan katalitik triada və katalitik mərkəz Ca yedəklə əhatə olunmuşdur.2+daha geniş şəraitdə yüksək ferment aktivliyini saxlayaraq sabitləşmə üçün bağlayıcı yerlər.
Spesifikasiya
| Görünüş | Ağdan ağlıya qədər amorf toz, liyofilləşmişdir |
| Xüsusi fəaliyyət | ≥40U/mq bərk |
| DNaz | Heç biri aşkarlanmadı |
| RNaz | Heç biri aşkarlanmadı |
| Bioyük | ≤50CFU/q bərk |
| Nuklein turşusu qalığı | <5pg/mg bərk |
Xüsusiyyətlər
| Mənbə | Tritirachium albomu |
| EC nömrəsi | 3.4.21.64(Tritirachium albomundan rekombinant) |
| Molekulyar çəki | 29kDa (SDS-PAGE) |
| İzoelektrik nöqtə | 7.81 Şəkil 1 |
| Optimal pH | 7.0-12.0 (hamısı yüksək fəaliyyət göstərir) Şəkil 2 |
| Optimal temperatur | 65℃ Şəkil 3 |
| pH sabitliyi | pH 4.5-12.5 (25℃,16h) Şəkil 4 |
| İstilik sabitliyi | 50℃-dən aşağı (pH 8.0, 30dəq) Fig.5 |
| Saxlama sabitliyi | 25℃ temperaturda 12 ay saxlanılır Fig.6 |
| Aktivləşdiricilər | SDS, karbamid |
| İnhibitorlar | diizopropil florofosfat;benzilsulfonil ftorid |
Saxlama şərtləri
Liyofilləşdirilmiş tozu -25~-15 ℃ temperaturda uzun müddət işıqdan uzaq saxlayın;Həll edildikdən sonra, işıqdan 2-8 ℃ uzaqda qısamüddətli və ya -25 ~ -15 ℃ işıqdan uzaqda uzunmüddətli saxlama üçün müvafiq həcmdə hissəciklər.
Ehtiyat tədbirləri
İstifadə edərkən və ya çəkərkən qoruyucu əlcək və eynək taxın və istifadə etdikdən sonra yaxşı havalandırın.Bu məhsul dərinin allergik reaksiyasına və ciddi göz qıcıqlanmasına səbəb ola bilər.Nəfəs aldıqda, allergiya və ya astma simptomlarına və ya nəfəs darlığına səbəb ola bilər.Tənəffüs yollarının qıcıqlanmasına səbəb ola bilər.
Vahid tərifi
NGS Proteaz K-nin bir vahidi standart təyin şərtləri altında kazeini 1 μmol L-tirozinə hidroliz etmək üçün tələb olunan fermentin miqdarı kimi müəyyən edilir.
Reagentlərin hazırlanması
| Reagent | İstehsalçı | Kataloq |
| Kazein texnikimal-qara südündən | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trixloroasetik turşu | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrium asetat | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Sirkə turşusu | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natrium karbonat | Sinopharm KimyaReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Şanxay)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozin | Sigma | 93829 |
Reagent I:
Substrat: iribuynuzlu süd məhlulundan 1% kazein: 1 q iribuynuzlu süd kazeini 50 ml 0,1 M natrium fosfat məhlulunda həll edin, pH 8,0, su hamamında 65-70 °C-də 15 dəqiqə qızdırın, qarışdırın və həll edin, su ilə sərinləyin, tənzimləyin. natrium hidroksid pH 8.0-ə qədər və 100 ml-ə qədər seyreltilir.
Reagent II:
TCA məhlulu: 0,1M trixloroasetik turşu, 0,2M natrium asetat və 0,3M sirkə turşusu (1,64 q trixloroasetik turşu + 1,64 q natrium asetat + 1,724 mL sirkə turşusu çəkin, ardıcıl olaraq 50 mL deionlaşdırılmış su əlavə edin, pH3 ilə seyreltin, pH3 ilə seyreltin. 100 ml).
Reagent III:
0,4 m natrium karbonat məhlulu (4,24 q susuz natrium karbonat çəkin və 100 ml suda həll edin)
Reagent IV:
Folin fenol reagenti: 5 dəfə deionlaşdırılmış su ilə seyreltilir.
Reagent V:
Ferment seyreltici: 0,1 M natrium fosfat məhlulu, pH 8,0.
Reagent VI:
L-tirozin standart məhlulu: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozin 0,2M HCl ilə həll edilir.
Prosedur
1. UV-Vis spektrofotometrini yandırın və fotometrik ölçməni seçin.
2. Dalğa uzunluğunu 660nm olaraq təyin edin.
3. Su banyosunu yandırın, temperaturu 37℃-ə qoyun, temperaturun 3-5 dəqiqə dəyişməməsini təmin edin.
4. 0,5 mL substratı 2 ml sentrifuqa borusunda 37 ℃ su banyosunda 10 dəqiqə əvvəlcədən qızdırın.
5. 0,5 mL seyreltilmiş ferment məhlulu 10 dəqiqə ərzində əvvəlcədən isidilmiş sentrifuqa borusuna çıxarın.Enzim seyrelticini boş qrup olaraq təyin edin.
6. Reaksiyadan dərhal sonra 1,0 ml TCA reagenti əlavə edin.Yaxşı qarışdırın və su banyosunda 30 dəqiqə inkubasiya edin.
7. Reaksiya məhlulunu sentrifuqalayın.
8. Göstərilən ardıcıllıqla aşağıdakı komponentləri əlavə edin.
| Reagent | Həcmi |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0.4M natrium karbonat | 2,5 ml |
| Folin fenol reagenti | 0,5 ml |
9. Su banyosunda 37°C temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya etməzdən əvvəl yaxşıca qarışdırın.
10. OD660OD kimi müəyyən edilmişdir1;boş nəzarət qrupu: OD müəyyən etmək üçün ferment məhlulunu əvəz etmək üçün ferment seyreltici istifadə olunur660OD kimi2, ΔOD=OD1-OD2.
11. L-tirozin standart əyri: 0,5 ml fərqli konsentrasiyalı L-tirozin məhlulu, 2,5 ml 0,4 M natrium karbonat, 5 ml sentrifuqa borusunda 0,5 ml Folin fenol reagenti, 37 ℃ temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edin, OD üçün aşkar edin660L-tirozinin müxtəlif konsentrasiyası üçün Y=kX+b standart əyrisi alındı, burada Y L-tirozinin konsentrasiyası, X OD-dir.600.
Hesablama
2: Reaksiya məhlulunun ümumi həcmi (mL)
0,5: Ferment məhlulunun həcmi (mL)
0,5: Xromogenin təyinində istifadə olunan reaksiya mayesinin həcmi (mL)
10: Reaksiya vaxtı (dəq)
Df: Çox qatılma
C: Ferment konsentrasiyası (mq/mL)
Rəqəmlər
Şəkil 1 DNT qalığı
| Nümunə | Ave C4 | Nuklein turşusu Bərpa (pg/mg) | Bərpa (%) | Ümumi nuklein turşu ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNTsiz H2O | Qeyri-müəyyən | — | — | — |
Fig.2 Optimal pH
Şəkil 3 Optimal temperatur
Şəkil 4 pH Sabitliyi
Şəkil 5 İstilik sabitliyi
Şəkil 6 25℃ temperaturda saxlama sabitliyi
