Proteinaz K mNGS (maye)
Proteinaz K geniş substrat spesifikliyinə malik stabil serin proteazdır.Yuyucu vasitələr olsa belə, yerli vəziyyətdə bir çox zülalları parçalayır.Kristal və molekulyar struktur tədqiqatlarının sübutları fermentin aktiv katalitik triadaya (Asp) malik subtilisin ailəsinə aid olduğunu göstərir.39-Onun69-Ser224).Əsas parçalanma yeri bloklanmış alfa amin qrupları olan alifatik və aromatik amin turşularının karboksil qrupuna bitişik olan peptid bağıdır.Geniş spesifikliyi üçün adətən istifadə olunur.Bu proteinaz K xüsusi olaraq mNGS üçün nəzərdə tutulmuşdur.Digər proteinaz K ilə müqayisədə o, eyni enzimatik performansa malik daha az nuklein turşusu ilə çirklənməni ehtiva edir ki, bu da aşağı axın mNGS tətbiqini daha yaxşı təmin edə bilər.
Saxlama şərtləri
2 il ərzində 2-8 ℃
Spesifikasiya
| Görünüş | Rəngsizdən açıq qəhvəyi maye |
| Fəaliyyət | ≥800 U/ml |
| Protein konsentrasiyası | ≥20 mq/ml |
| Nikase | Heç biri aşkarlanmadı |
| DNaz | Heç biri aşkarlanmadı |
| RNaz | Heç biri aşkarlanmadı |
Xüsusiyyətlər
| EC nömrəsi | 3.4.21.64(Tritirachium albomundan rekombinant) |
| İzoelektrik nöqtə | 7.81 |
| Optimal pH | 7.0- 12.0 Şəkil 1 |
| Optimal temperatur | 65 ℃ Şəkil 2 |
| pH sabitliyi | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 saat) Şəkil 3 |
| İstilik sabitliyi | 50 ℃-dən aşağı (pH 8.0, 30 dəq) Şəkil 4 |
| Saxlama sabitliyi | 25 ℃ temperaturda 12 ay ərzində 90%-dən çox aktivlik |
| Aktivləşdiricilər | SDS, karbamid |
| İnhibitorlar | diizopropil florofosfat;fenilmetilsulfonil ftorid |
Tətbiqlər
1. Genetik diaqnostika dəsti
2. RNT və DNT ekstraksiya dəstləri
3. Dokulardan zülal olmayan komponentlərin çıxarılması, DNT kimi zülal çirklərinin deqradasiyasıpeyvəndlər və heparinin hazırlanması
4. Xromosom DNT-nin impulslu elektroforezlə hazırlanması
5. Qərb ləkəsi
6. Enzimatik qlikosilləşdirilmiş albumin reagentləri in vitro diaqnostikası
Ehtiyat tədbirləri
İstifadə edərkən və ya çəkərkən qoruyucu əlcək və eynək taxın və istifadə etdikdən sonra yaxşı havalandırın.Bu məhsul dərinin allergik reaksiyasına və ciddi göz qıcıqlanmasına səbəb ola bilər.Nəfəs aldıqda, allergiya və ya astma simptomlarına və ya nəfəs darlığına səbəb ola bilər.Tənəffüs yollarının qıcıqlanmasına səbəb ola bilər.
Vahid tərifi
Bir vahid (U) 1 μmol istehsal etmək üçün kazeini hidroliz etmək üçün tələb olunan fermentin miqdarı kimi müəyyən edilir.aşağıdakı şərtlərdə dəqiqədə tirozin.
Reagentlərin hazırlanması
Reagent I: 1 q süd kazeini 50 ml 0,1 M natrium fosfat məhlulunda (pH 8,0) həll edildi, 65-70 ℃ suda 15 dəqiqə inkubasiya edildi, qarışdırıldı və həll edildi, su ilə soyuduldu, natrium hidroksid ilə pH 8,0-a uyğunlaşdırıldı və fiksasiya olundu. 100ml.
Reagent II: 0,1M trixloroasetik turşu, 0,2M natrium asetat, 0,3M sirkə turşusu.
Reagent III: 0.4M Na2CO3həll.
IV reagent: Forint reagenti təmiz su ilə 5 dəfə seyreltilir.
Reagent V: Ferment həlledicisi: 0,1M natrium fosfat məhlulu (pH 8,0).
Reagent VI: tirozin məhlulu: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozin 0,2 ilə həll edilmişdir.M HCl.
Prosedur
1. 0,5 ml reagent I 37 ℃-ə qədər qızdırılır, 0,5 ml ferment məhlulu əlavə edin, yaxşı qarışdırın və inkubasiya edin.37 ℃ 10 dəqiqə.
2. Reaksiyanı dayandırmaq üçün 1 ml reagent II əlavə edin, yaxşı qarışdırın və 30 dəqiqə inkubasiyaya davam edin.
3. Reaksiya məhlulunu sentrifuqa edin.
4. 0,5 ml supernatant götürün, 2,5 ml reagent III, 0,5 ml reagent IV əlavə edin, yaxşı qarışdırın və 37 ℃ temperaturda inkubasiya edin.30 dəq.
5. OD660OD kimi müəyyən edilmişdir1;boş nəzarət qrupu: 0,5 ml reagent V fermenti əvəz etmək üçün istifadə olunurOD müəyyən etmək üçün həll660OD kimi2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tirozin standart əyri: 0,5 ml fərqli konsentrasiyalı L-tirozin məhlulu, 2,5 ml reagent III, 5 ml sentrifuqa borusunda 0,5 ml reagent IV, 37 ℃ temperaturda 30 dəqiqə inkubasiya edin, OD üçün aşkar edin660L-tirozinin müxtəlif konsentrasiyası üçün Y=kX+b standart əyrisi alındı, burada Y L-tirozinin konsentrasiyası, X OD-dir.600.
Hesablama
2: Reaksiya məhlulunun ümumi həcmi (mL)
0,5: Ferment məhlulunun həcmi (mL)
0,5: Xromogenin təyinində istifadə olunan reaksiya mayesinin həcmi (mL)
10: Reaksiya vaxtı (dəq)
Df: Çox qatılma
C: Ferment konsentrasiyası (mq/mL)
İstinadlar
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofiz.Res.Kommun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.və başqaları,Avro.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molekulyar Klonlaşdırma: Laboratoriya Təlimatı, 2-ci nəşr, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Rəqəmlər
Şek.1 Optimal pH
100 mM bufer məhlulu: pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glisin-NaOH.Ferment konsentrasiyası:1mq/mL
Şəkil 2 Optimal temperatur
20 mM K-fosfat tamponunda reaksiya pH 8.0.Ferment konsentrasiyası: 1 mq/mL
Şəkil 3 pH Sabitlik
25 ℃, 16 saat 50 mM bufer məhlulu ilə müalicə: pH 4,5- 5,5, Asetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glisin-NaOH.Ferment konsentrasiyası: 1 mq/mL
Şəkil 4 Termal sabitlik
50 mM Tris-HCl tamponu ilə 30 dəqiqəlik müalicə, pH 8.0.Ferment konsentrasiyası: 1 mq/mL
Şəkil 5 Saxlama sabitty at 25℃
