RTL tərs transkriptaza
RTL tərs transkriptaza 3'→5' ekzonükleaz aktivliyinə malik olmayan və RNaz H aktivliyinə malik olan RNT şablonundan asılı DNT polimerazdır.Bu ferment RNT-dən DNT-nin tamamlayıcı zəncirini sintez etmək üçün şablon kimi istifadə edə bilər ki, bu da birinci zəncir cDNT sintezinə, xüsusən də RT-LAMP (döngü vasitəçiliyi ilə izotermik gücləndirmə) üçün tətbiq oluna bilər.RTL tərs transkriptaza 1.0 ilə müqayisədə həssaslıq əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşır, istilik sabitliyi daha güclüdür və 65 ° C-də reaksiya daha sabitdir.RTL tərs transkriptaza (qliserolsuz) liyofilləşdirilmiş preparatlar, liyofilləşdirilmiş RT-LAMP reagentləri və s. hazırlamaq üçün istifadə edilə bilər.
Vahid Tərifi
Bir vahid şablon-primer kimi poli(A)•oligo(dT)25 istifadə edərək, 50°C-də 20 dəqiqə ərzində 1 nmol dTTP-ni turşu-çökə bilən materiala daxil edir.
Komponentlər
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Əks Transkriptaza (Qliserinsiz) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL tamponu | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Saxlama Vəziyyəti
0°C altında daşınmalı və -25°C~-15°C temperaturda saxlanılmalıdır.
Keyfiyyətə nəzarət
- Qalıq FəaliyyətiEnononukleaz:1 μg λDNT və 15 vahid RTL2.0 ehtiva edən 50 μL reaksiya, 37 ℃ temperaturda 16 saat inkubasiya edilmiş, gel elektroforezi ilə mənfi nəzarətlə eyni nümunəni göstərir.
- Qalıq FəaliyyətiExonuclease:1 μg Hind Ⅲ həzm olunmuş λDNT və 15 vahid RTL2.0 ehtiva edən 50 μL reaksiya, 37 ℃ temperaturda 16 saat inkubasiya edilmiş, gel elektroforezi ilə mənfi nəzarətlə eyni nümunəni göstərir.
- Qalıq FəaliyyətiNikase:37°C-də 4 saat inkubasiya edilmiş 1 μg supercoiled pBR322 və 15 vahid RTL2.0 ehtiva edən 50 μL reaksiya gel elektroforezi ilə mənfi nəzarətlə eyni nümunəni göstərir.
- Qalıq FəaliyyətiRNaz:37°C-də 4 saat inkubasiya edilmiş 0,48 μg MS2 RNT və 15 vahid RTL2.0 ehtiva edən 10 μL reaksiya gel elektroforezi ilə mənfi nəzarətlə eyni nümunəni göstərir.
- E. coli gDNT:ilə ölçülürE.colixüsusi HCD aşkarlama dəstləri， 15 vahid RTL2.0 1-dən az ehtiva edirE. coligenom.
Reaksiya Quraşdırma
cDNA sintez protokolu
| Komponentlər | Həcmi |
| Şablon RNT a | isteğe bağlıdır |
| Oliqo(dT) 18~25(50uM) və ya Təsadüfi Astar qarışığı(60uM) | 2 μL |
| dNTP Qarışığı (hər biri 10 mM) | 1 μL |
| RNaz inhibitoru (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Əks Transkriptaza 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL tamponu | 2 μL |
| Nukleazsız Su | 20 μL-ə qədər |
Qeydlər:
1) Ümumi RNT-nin tövsiyə olunan dozası 1ng~1μg-dir
2) mRNT-nin tövsiyə olunan dozası 50ng~100ng idi
Termo-Velosiped sürmə Gündəlik üçün şərtlər reaksiya:
| Temperatur (°C) | Vaxt |
| 25 °Ca | 5 dəq |
| 55 °C | 10 dəqb |
| 80 °C | 10 dəq |
Qeydlər:
1) Random Primer Mix istifadə edilərsə, 25°C-də inkubasiya mərhələsi.
2) Hədəf primer qarışığı istifadə edilərsə, 55°C-də 10~30 dəqiqə ərzində inkubasiya mərhələsi.
RT-LAMP Protokolu
| Komponentlər | Həcmi | Son Konsentrasiya |
| Şablon RNT | isteğe bağlıdır | ≥10 nüsxə |
| dNTP Qarışığı (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mm |
| FIP/BIP Astarlar (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Astarlar (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB Astarları (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNaz inhibitoru (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksiya |
| RTL Əks Transkriptaza 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Reaksiya |
| Bst V2 DNT Polimeraz (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksiya |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (Ümumi 8 mM) |
| 10×HC RTL Bufer (və ya 10×HC Bst V2 Bufer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nukleazsız Su | 25 μL-ə qədər | - |
Qeydlər:
1) Burulğanla qarışdırın və toplamaq üçün qısa müddətə sentrifuqa edin.1 saat ərzində 65°C-də sabit temperaturda inkubasiya.
2) İki tampon bir-birinə uyğundur və eyni tərkibə malikdir.
Qeydlər
1.Bu məhsul -20 °C-də saxlandıqda ağ bərk maddə əmələ gətirir.Onu -20°C-dən çıxarın və təxminən 10 dəqiqə buzun üzərinə qoyun.Əriddikdən sonra çalxalayaraq qarışdıraraq istifadə etmək olar.
2. cDNA məhsulu -20°C və ya -80°C-də saxlanıla bilər və ya dərhal PCR reaksiyası üçün istifadə edilə bilər.
3. RNase ilə çirklənməsinin qarşısını almaq üçün, lütfən, eksperimental ərazini təmiz saxlayın və əməliyyat zamanı təmiz əlcək və maskalar taxın.
