M-MLV Neoscript Reverse Transkriptaza
Neoscript Reverse Transkriptaza E.coli-də Moloney fare leykemiya virusunun mənşəli və ifadəsinin M-MLV geninin mutasiya skrininqi ilə əldə edilən əks transkriptazadır.Ferment RNase H aktivliyini aradan qaldırır, daha yüksək temperatur tolerantlığına malikdir və yüksək temperaturda əks transkripsiyaya uyğundur.Buna görə də, RNT-nin yüksək səviyyəli strukturunun və qeyri-spesifik amillərin cDNT sintezinə mənfi təsirlərini aradan qaldırmaq üçün faydalıdır və daha yüksək sabitliyə və əks transkripsiya sintezi qabiliyyətinə malikdir.Ferment daha yüksək sabitliyə və əks transkripsiya sintezi qabiliyyətinə malikdir.
Komponentlər
1.200 U/μL Neoscript Əks Transkriptaza
2.5 × Birinci Strand Bufer (isteğe bağlı)
* 5 × First-Strand Buferdə dNTP yoxdur, lütfən reaksiya sistemini hazırlayarkən dNTP əlavə edin
Tövsiyə olunan tətbiq
1.Bir addımlı qRT-PCR.
2.RNT virusunun aşkarlanması.
Saxlama Vəziyyəti
Uzunmüddətli saxlama üçün -20°C, istifadə etməzdən əvvəl yaxşıca qarışdırılmalıdır, tez-tez donma-ərimədən qaçın.
Vahid Tərifi
Bir vahid poli(A)•oligo(dT) istifadə edərək 37°C-də 10 dəqiqə ərzində 1 nmol dTTP-ni birləşdirir.25şablon/astar kimi.
Keyfiyyətə nəzarət
1.SDS-PAGE elektroforetik təmizlik 98%-dən çox.
2.Gücləndirmə həssaslığı, partiyadan partiyaya nəzarət, sabitlik.
3.Ekzogen nukleaz aktivliyi, ekzogen endonükleaz və ya ekzonükleaz çirklənməsi yoxdur
Birinci Zəncirvari Reaksiya Həlli üçün Reaksiya Quraşdırma
1.Reaksiya qarışığının hazırlanması
| Komponentlər | Həcmi |
| Oliqo(dT)12-18 Astar və ya Random Primera Və ya Gen Xüsusi Primerlərb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Şablon RNT | Ümumi RNT≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNazsız dH2O | 10 μL-ə qədər |
Qeydlər:a/b: Təcrübə ehtiyaclarınıza uyğun olaraq müxtəlif növ primerlər seçin.
2.65°C-də 5 dəqiqə qızdırın və 2 dəqiqə buz üzərində sürətlə soyudun.
3.Aşağıdakı komponentləri yuxarıdakı sistemə ümumi həcmi 20µL əlavə edin və yumşaq qarışdırın:
| Komponentlər | Həcmi (μL) |
| 5 × Birinci Strand Bufer | 4 |
| Neoscript Reverse Transkriptaza (200 U/μL) | 1 |
| RNaz inhibitoru (40 U/μL) | 1 |
| RNazsız dH2O | 20 μL-ə qədər |
4. Zəhmət olmasa reaksiyanı aşağıdakı şərtlərə uyğun yerinə yetirin:
(1) Təsadüfi Astar istifadə edilərsə, reaksiya 10 dəqiqə ərzində 25 ℃ temperaturda, sonra isə 30 ~ 60 dəqiqə ərzində 50 ℃ temperaturda aparılmalıdır;
(2) Oligo dT və ya xüsusi primerlərdən istifadə edilərsə, reaksiya 50°C temperaturda 30~60 dəqiqə ərzində aparılmalıdır.
5.Neoscript Reverse Transkriptazasını təsirsiz hala gətirmək və reaksiyanı dayandırmaq üçün 5 dəqiqə 95 ℃ temperaturda qızdırın.
6.Əks transkripsiya məhsulları birbaşa PCR reaksiyasında və flüoresan kəmiyyət PCR reaksiyasında istifadə edilə bilər və ya uzun müddət -20 ℃ temperaturda saxlanıla bilər.
PCR Rhərəkət:
1.Reaksiya qarışığının hazırlanması
| Komponentlər | Konsentrasiya |
| 10 × PCR Bufer (dNTP pulsuz, Mg²+ pulsuz) | 1× |
| dNTPs (hər dNTP 10mM) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNT Polimeraz (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Şablona | ≤10% İlk Zəncirvari Reaksiya Məhlulu (2 μL) |
| gg2O | 50 μL-ə qədər |
Qeydlər:a: Əgər çoxlu birinci zəncirvari reaksiya məhlulu əlavə edilərsə, PCR reaksiyası maneə törədilə bilər.
2.PCR Reaksiya Proseduru
| addım | Temperatur | Vaxt | Velosipedlər |
| Əvvəlcədən denaturasiya | 95℃ | 2-5 dəq | 1 |
| Denatürasiya | 95℃ | 10-20 san | 30-40 |
| Qızartma | 50-60 ℃ | 10-30 san | |
| Uzatma | 72℃ | 10-60 san |
Qeydlər
1.42 ℃ ~ 55 ℃ aralığında tərs transkripsiya temperaturunun optimallaşdırılması üçün uyğundur.
2.Daha yaxşı sabitliyə malikdir, yüksək temperaturda əks transkripsiya gücləndirilməsi üçün uyğundur.Bundan əlavə, RNT-nin mürəkkəb struktur bölgələrindən səmərəli şəkildə keçmək üçün əlverişlidir.Həmçinin, obir addımlı multipleks flüoresan kəmiyyət RT-PCR aşkarlanması üçün uyğundur.
3.Müxtəlif PCR gücləndirmə fermentləri ilə yaxşı uyğunluq və yüksək həssaslıq RT-PZR reaksiyaları üçün uyğundur.
4.Yüksək həssaslıqlı bir addımlı flüoresan kəmiyyət RT-PCR reaksiyası üçün uyğundur, şablonların aşağı konsentrasiyasının aşkarlanma sürətini effektiv şəkildə yaxşılaşdırır.
5.cDNA kitabxanasının qurulması üçün uyğundur.
