Rnase inhibitoru
Fare RNaz inhibitoru E.coli-dən ifadə edilmiş və təmizlənmiş rekombinant siçan RNaz inhibitorudur.Qeyri-kovalent bağlanma yolu ilə 1:1 nisbətində A, B və ya C RNase ilə birləşir və bununla da üç fermentin fəaliyyətini maneə törədir və RNT-ni deqradasiyadan qoruyur.Bununla belə, Aspergillus-dan RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H və ya RNase-ə qarşı təsirli deyil.Sıçan RNaz inhibitoru RT-PCR, RT-qPCR və IVT mRNA ilə sınaqdan keçirilmiş və müxtəlif kommersiya Reverse transkriptazaları, DNT polimerazaları və RNT polimerazaları ilə uyğun olmuşdur.
İnsan RNaz inhibitorları ilə müqayisədə, fare RNase inhibitoru inhibitorun təsirsizləşməsinə səbəb olan oksidləşməyə yüksək həssas olan iki sistein ehtiva etmir.Bu onu aşağı DTT konsentrasiyalarında (1 mM-dən az) sabit edir.Bu xüsusiyyət onu yüksək DTT konsentrasiyalarının reaksiyaya mənfi təsir göstərdiyi reaksiyalarda istifadə üçün münasib edir (məsələn, Real-time RT-PCR).
Aərizə
Bu məhsul RNT deqradasiyasının qarşısını almaq üçün RNaz müdaxiləsinin mümkün olduğu istənilən təcrübədə geniş şəkildə istifadə edilə bilər, məsələn:
1.cDNT-nin birinci zəncirinin sintezi, RT-PCR, RT-qPCR və s.
2.In vitro transkripsiya/tərcümə zamanı RNT-ni deqradasiyadan qoruyur (məsələn, in vitro viral replikasiya sistemi).
3.RNT-nin ayrılması və təmizlənməsi zamanı RNaz fəaliyyətinin qarşısının alınması.
Saxlama şərtləri
Məhsul -25～-15 ℃ temperaturda saxlanıla bilər, etibarlılıq müddəti 2 ildir.
Saxlama buferi
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT və 50% qliserin.
Vahid tərifi
5 ng ribonukleaza A-nın fəaliyyətini 50% inhibə etmək üçün tələb olunan siçan RNaz inhibitorunun miqdarı bir vahid (U) kimi müəyyən edilmişdir.
Zülalın molekulyar çəkisi
Sıçan RNaz inhibitorunun molekulyar çəkisi 50 kDa-dır.
Keyfiyyətə nəzarət
Exonuclease Fəaliyyət:
1 μg λ -Hind III həzm DNT ilə 40 U siçan RNaz inhibitoru 37 ℃ temperaturda 16 saat ərzində agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.
Endonukleaz fəaliyyəti:
16 saat ərzində 37 ℃ temperaturda 1μ g λ DNT ilə siçan RNaz inhibitorunun 40 U, agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.
Nicking Fəaliyyət:
16 saat ərzində 37°C temperaturda 1μg pBR322 ilə 40U siçan RNase inhibitoru agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.
RNaz Fəaliyyət:
37 ℃ temperaturda 4 saat ərzində 1,6μg MS2 RNT ilə 40U siçan RNaz inhibitoru agaroz gel elektroforezi ilə müəyyən edildiyi kimi heç bir deqradasiya vermir.
E.coli DNT:
40 U siçan RNaz inhibitoru E. coli 16S rRNA lokusu üçün spesifik primerlərlə TaqMan qPCR istifadə edərək E. coli genomik DNT-nin varlığı üçün yoxlanılır.E. coli genomik DNT çirklənməsi ≤ 0,1 pg/40 U təşkil edir.
Notes
1. Şiddətli salınım və ya qarışdırma fermentin inaktivasiyasına səbəb olacaq.
2. Bu inhibitorun optimal temperatur diapazonu 25-55 ℃ idi və 65 ℃ və yuxarıda təsirsiz hala gəldi.
3. RNase H, RNase 1 və RNase T1-in fəaliyyətləri siçan RNaz inhibitoru tərəfindən inhibə edilməmişdir.
4.RNaz fəaliyyətinin inhibəsi geniş pH diapazonunda aşkar edilmişdir (pH 5-9 hamısı aktiv idi) və ən yüksək aktivlik pH 7-8-də müşahidə edilmişdir.
5. Ribonükleazlar adətən denaturasiya şəraitində fəaliyyətini saxladığından, ribonukleaza ilə kompleksləşmiş RNaz İnhibitoru molekullarının denaturasiyasının qarşısını almaq üçün diqqətli olmaq lazımdır.Aktiv ribonukleazın sərbəst buraxılmasının qarşısını almaq üçün 50 °C-dən yuxarı temperaturdan və karbamidin və ya digər denaturasiyaedici maddələrin yüksək konsentrasiyalarından çəkinmək lazımdır.
