DNT Extraction Mini Kit
Bu dəst optimallaşdırılmış bufer sistemini və 70 bp – 20 kb DNT fraqmentlərini TAE və ya TBE agaroza gelinin müxtəlif konsentrasiyalarından bərpa edə bilən silika gel sütununun təmizlənməsi texnologiyasını qəbul edir.DNT adsorbsiya sütunu yüksək duzlu şəraitdə DNT-ni xüsusi adsorblaya bilər.Bundan əlavə, dəst birbaşa PCR məhsullarından, fermentativ reaksiya sistemlərindən və ya digər üsullarla əldə edilən xam DNT məhsullarından DNT fraqmentlərini təmizləyə və zülallar, digər üzvi birləşmələr, qeyri-üzvi duz ionları və oliqonukleotid primerləri kimi çirkləri təmizləyə bilər.Təmizləmənin 10-15 dəqiqə ərzində tamamlanmasını təmin edə bilər.Təmizlənmiş DNT birbaşa bağlama, transformasiya, ferment həzm, in vitro transkripsiya, PCR, ardıcıllıq, mikroinyeksiya və s. üçün istifadə edilə bilər.
Saxlama şəraiti
-15 ~ -25 ℃ temperaturda saxlayın və otaq temperaturunda nəql edin.
Komponentlər
| Komponentlər | (100 rxns) |
| Bufer ÜDM | 80 ml |
| Bufer GW | 2 × 20 ml |
| Elüsyon tamponu | 20 ml |
| FastPure DNT Mini Sütunları-G | 100 |
Bufer ÜDM:DNT bağlayıcı tampon.
Bufer GW:yuyucu tampon;istifadə etməzdən əvvəl şüşə üzərində göstərilən həcmdə mütləq etanol əlavə edin.
Elüsyon tamponu:Elüsyon.
FastPure DNT Mini Sütunları-G:DNT adsorbsiya sütunları.
Kolleksiya boruları 2 ml:Filtrat üçün toplama boruları.
Hazırlanmış Materiallar
1,5 ml sterilizasiya edilmiş borular, mütləq etanol və izopropanol (DNT fraqmenti ≤100 bp olduqda, 1 həcm əlavə edin)
izopropanoldan 1 həcm jelə qədər), su banyosu.
Təcrübə Prosesi
İstifadədən əvvəl etiketdə göstərildiyi kimi Buffer GW-ni seyreltmək üçün 80 ml etanol əlavə edin, otaq temperaturunda saxlayın.
Mexanizm
1. PCR reaksiya həlli
Gel ekstraksiya sxemi: Bərabər həcmdə Bufer GDP PCR reaksiya məhlulunun bərpa sxemi əlavə edin:Həcmi 5 dəfə bufer əlavə edin
2. ÜDM Gelin həcmini hesablayın(100 μl 100 mq-a bərabərdir)
Gel həll edin
3. Əvvəlcədən 50 ~ 55 dərəcə qızdırın℃
4. Bağlama Yuma
300 μL Bufer ÜDM əlavə edin*
700 μL Bufer GW əlavə edin
700 μL Bufer GW əlavə edin
5. Elute
20-30μL Elüsyon Tamponu və ya deionlaşdırılmış su əlavə edin
Qeydlər* Bu addım olmadan PCR reaksiyası mayesinin bərpası
Gel çıxarma proqramı
1. DNT fraqmentlərinin fraksiyalaşdırılması üçün DNT elektroforezindən sonra, ultrabənövşəyi şüa altında agaroza geldən DNT fraqmentinin tək zolağı aksizlə çıxarılır.Gelin görünən nəmini udmaq və mümkün qədər əlavə agarozu çıxararaq gel diliminin ölçüsünü minimuma endirmək üçün uducu kağızdan istifadə etmək tövsiyə olunur.Həcmini hesablamaq üçün gel dilimini (mikrosentrifuqa borusu olmadan) çəkin: Sıxlığın 1q/ml olduğunu nəzərə alaraq, 100 mq jel diliminin həcmi təxminən 100 μL-dir.
2. Bərabər həcmdə Bufer ÜDM əlavə edin, 50~55 ℃ temperaturda 7-10 dəqiqə inkubasiya edin (gelin ölçüsünə uyğun olaraq, gel tamamilə həll olunana qədər inkubasiya müddətini tənzimləyin).İnkubasiya zamanı borunu 2 dəfə çevirin.
Δ Bufer ÜDM-in 1-3 həcminin əlavə edilməsi DNT-nin bərpasının effektivliyinə təsir etməyəcək.Əgər bərpa olunacaq DNT fraqmenti <100 bp, Bufer ÜDM-in 3 həcmi əlavə edilməlidir;gel dilimi tamamilə həll edildikdə, 1 həcm izopropanol əlavə edin və hərtərəfli qarışdırın, sonra növbəti addıma davam edin.
3. Nümunəni borunun dibinə gətirmək üçün qısa müddətə sentrifuqa edin, FastPure DNT Mini Columns-G-ni 2 ml toplama borularına daxil edin, diqqətlə gündə bir dəfə maksimum 700 μL məhlulu köçürün.
filtrasiya sütunlarına qədər vaxt, 12,000 rpm (13,800 X g) 30-60 saniyə sentrifuqa edin.
4. Filtratı atın və sütuna 300 μL Bufer ÜDM əlavə edin, otaq temperaturunda 1 dəqiqə inkubasiya edin, 12,000 rpm (13,800 X g) 30-60 saniyə sentrifuqa edin.
5. Filtratı atın və sütuna 700 μL Buffer GW əlavə edin (əvvəlcədən mütləq etanolun əlavə edilib-edilmədiyini yoxlayın!), 30-60 saniyə ərzində 12,000 rpm (13,800 X g) sentrifuqa edin.
Δ Lütfən, adsorbsiya sütunu divarının ətrafına Bufer GW əlavə edin və ya Bufer GW arxa qapağı əlavə edin və boru divarına yapışan duzun tamamilə yuyulmasına kömək etmək üçün onu 2-3 dəfə tərs qarışdırın.
6. 5-ci addımı təkrarlayın.
Δ Bufer GW ilə iki dəfə yuyulma duzun tamamilə çıxarılmasını təmin edə və sonrakı təcrübələrə təsirini aradan qaldıra bilər.
7. Filtratı atın və boş sütunu 12,000 rpm (13,800 X g) sürətlə 2 dəqiqə sentrifuqa edin.
8. Sütunu təmiz 1,5 ml mikrosentrifüj borusuna daxil edin, sütun membranının mərkəzinə 20 - 30 μL Elüsyon Tamponu əlavə edin, 2 dəqiqə inkubasiya edin və sonra 1 dəqiqə ərzində 12,000 rpm (13,800 X g) sentrifuqa edin.Sütunu atın, alınan DNT-ni -20-də saxlayın.
Δ 8-ci addımın supernatantını yenidən elüt etmək üçün sütuna köçürmək və Elüsyon Buferini 55-ə qədər qızdırmaq (DNT fraqmenti >3 kb olduqda) bərpa səmərəliliyini artırmaq üçün faydalı ola bilər.
PCR məhsullarının bərpası proqramı
Bu protokol PCR məhsullarından, enzimatik reaksiya sistemindən və digər xam DNT məhsullarından (genetik DNT daxil olmaqla) DNT fraqmentlərini təmizləmək üçün tətbiq edilir.Bu məhlul müxtəlif nukleotidləri, primerləri, primer dimerləri, duz molekullarını, fermentləri və digər çirkləri effektiv şəkildə təmizləyə bilir.
1. PCR məhsullarını, enzimatik reaksiya məhlulunu və digər xam DNT məhsullarını qısaca sentrifuqa edin.Onların həcmini pipetlə təxmin edin və sterilizasiya olunmuş 1,5 ml və ya 2 ml boruya köçürün.Həcmi 100 μL-ə qədər olana qədər ddH2O əlavə edin;yüksək konsentrasiyalı genomik DNT üçün isə ddH2O ilə 300 μL-ə qədər seyreltmə bərpa effektivliyini artırmağa kömək edəcək.
2. Bufer ÜDM-in 5 həcmi əlavə edin, ters çevirərək və ya burulğan edərək hərtərəfli qarışdırın.Əgər maraq doğuran DNT fraqmenti >100 bp olarsa, əlavə 1,5 həcm (nümunələr + Bufer ÜDM) etanol əlavə edilməlidir.
3. Sütunu yenidən toplama borusuna daxil edin, qarışığı sütuna köçürün, 12,000 rpm (13,800 × g) sürətlə 30 – 60 saniyə sentrifuqa edin.Qarışıq məhlulun həcmi >700 µL olarsa, adsorbsiya sütununu yenidən toplama borusuna qoyun, qalan məhlulu adsorbsiya sütununa köçürün və 12,000 rpm (13,800 × g) sürətlə 30 – 60 saniyə sentrifuqa edin.
4. Növbəti performans 08-1/Gel çıxarılması proqramının 5-8 addımlarına aiddir.
Tətbiqlər
TAE və ya TBE agaroz gelinin müxtəlif konsentrasiyaları;Müxtəlif üsullarla əldə edilən PCR məhsulları, enzimatik reaksiya sistemləri və ya digər xam DNT məhsulları.arasından bərpa edilən fraqmentlər70 bp -20 kb.
Qeydlər
Yalnız tədqiqat istifadəsi üçün.Diaqnostik prosedurlarda istifadə olunmur.
1. İstifadədən əvvəl etiketdə göstərildiyi kimi Bufer GW-ni seyreltmək üçün 80 ml etanol əlavə edin, otaq temperaturunda saxlayın.
2. Bufer ÜDM aşağı temperaturda saxlama zamanı asanlıqla çökə bilərsə, istifadə etməzdən əvvəl bir müddət otaq temperaturunda yerləşdirilə bilər.Lazım gələrsə, çöküntü tamamilə həll olunana qədər 37 ° C su banyosunda əvvəlcədən qızdırıla bilər və sonra qarışdırıldıqdan sonra istifadə edilə bilər.
3. Su banyosunun temperaturunu əvvəlcədən 50 ~ 55 ℃-ə təyin edin.
4. 08-1/Gel ekstraksiya proqramının 1-ci addımında gel diliminin ölçüsünü minimuma endirmək həll olma müddətini əhəmiyyətli dərəcədə azaldacaq və bərpa səmərəliliyini artıracaq (Xəttiləşdirilmiş DNT davamlı yüksək temperaturda məruz qaldıqda asanlıqla hidrolizə olunur).DNT gelini uzun müddət UV şüalarına məruz qoymayın, çünki ultrabənövşəyi işıq DNT-nin zədələnməsinə səbəb ola bilər.
5. 08-1/Gel ekstraksiya proqramının 2-ci addımında geli tamamilə həll edin, əks halda DNT-nin bərpasının səmərəliliyi ciddi şəkildə təsirlənəcək.
6. Elüsyon tamponunu və ya ddH2O-nu 55℃-ə qədər əvvəlcədən qızdırın, bu, DNT-nin elüsyonunun səmərəliliyini artırmaq üçün faydalıdır.DNT-ni 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5 eluentdə saxlamaq tövsiyə olunur.
